A Sumetrolim hatékonyságának in vitro vizsgálatakor a táptalaj thymidin/thymin koncentrációja jelentősen befolyásolhatja a korongdiffúziós módszer során a gátlási zóna átmérőjét. Az olyan baktériumok esetében, amelyeknél a baktérium megfelelő növekedése a táptalaj vérrel történő kiegészítését igényli, a Sumetrolim érzékenység meghatározására csak lizált lóvér javasolt a National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS) alapján. A lizált lóvér nem, vagy csak elenyésző mennyiségben tartalmaz gátló anyagokat, szemben a hazai viszonylatban elterjedten használt marhavérrel. 1998 augusztus 1 és december 31 között laboratóriumunkban izolált 100-100 Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae és Moraxella catarrhalis törzs Sumetrolim érzékenységét vizsgáltuk meg. A rutinban használt 5% marhavér tartalmú táptalajok mellett párhuzamosan 5% lizált lóvér tartamú táptalajokon is elvégeztük a rezisztencia meghatározást, minden törzs esetében. Az alaptáptalaj, a vizsgált baktérium inokuluma, az inkubációs körülmények minden esetben azonosak voltak.
Jelentősen nagyobb százalékban voltak a törzsek érzékenyek Sumetrolimmal szemben, ha a vizsgálatot lóvér tartalmú táptalajon végeztük. Hasonlóan magasabb volt az érzékenység, ha a Haemophilus influenzae törzseket HTM, a Moraxella catarrhalis izolátumokat vérmentes Mueller -Hinton agar táptalajon vizsgáltuk. A Streptococcus pneumoniae törzsek Sumetrolim érzékenységének meghatározása a kontrolláltan alacsony thymidin koncentrációjú marhavéres táptalajon szintén megbízható eredményt adott.
A Sumetrolim (co-trimoxazol) a sulphametoxazol és a trimethoprim 5:1 arányú stabil kombinációja. A két komponens szinergista hatású, a bakteriális fólsavszintézis két különböző pontján hatva akadályozzák olyan DNS alkotórészek felépülését, mint a purinok és a pirimidinek. Míg a kombinációban lévő szulfonamid a p-amino-benzoesav dihidrofolsavvá alakulását gátolja, addig a trimethoprim a dihidrofolsav-reduktáz gátlásával a dihidrofolsav tetrahidrofolsavvá redukálását akadályozza. A kombináció baktericid hatású és a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok széles körére hatásos.
Az in vitro érzékenységi vizsgálatok során már 1971-ben Koch és Burchall (1) felhívta a figyelmet, hogy az érzékenységi adatokat jelentősen befolyásolhatják a nem szintetikus táptalajokban jelenlévő gátló anyagok. Így a PABA a sulfonamidok hatását függesztheti fel, míg főleg a trimethoprim gátlása révén a thymidin, esetleg ribonucleosidok, aminosavak, vitaminok szintén téves rezisztens adatokhoz vezethetnek. Kimutatták, hogy ha a thymidin mennyiségét a táptalajban egy kritikus érték alatt tartják a trimethoprim hatékonyságának gátlása megszűnik. Harper és Cawston (2) empirikus alapon azt találta, hogy a lizált lóvér felfüggeszti a táptalajok trimethoprim antagonista hatását, ami a lóvérben a vörösvérsejtekből felszabaduló thymidin-phosphorilase enzimatikus hatásának következménye. Az enzim a thymidint thyminné alakítja, melynek gátló hatása 100-szor kisebb. Mindezek ismeretében az in vitro rezisztencia vizsgálatokat szabályozó különböző ajánlások, így a National Committee of Clinical Laboratory Standards (NCCLS) is felhívja a figyelmet a co-trimoxazol (Sumetrolim) vizsgálatánál arra, hogy az alkalmazott Mueller-Hinton táptalaj esetében kontrollálni kell ismert gátlási zónájú referencia törzzsel (az Enterococcus faecalis ATCC 29212 vagy ATCC 33186 jelzésű törzs), hogy az alkalmazott táptalajban megfelelően alacsony-e a thymidin koncetráció. Amennyiben a kontroll törzs körül >=20 mm-es, mikrotelepektől mentes tiszta gátlási zónát észlelünk, a táptalaj thymidin koncentrációja megfelelően alacsony szintű a co-trimoxazol in vitro hatékonyságának vizsgálatára. Azon baktériumok esetében, ahol a baktérium megfelelő növekedése a táptalaj vérrel történő kiegészítését igényli, a co-trimoxazol in vitro érzékenységének vizsgálatára csak lizált lóvér kiegészítés javasolt. Más állatból származó vér (marhavér, birkavér) olyan mennyiségben tartalmazhat thymidint, ami jelentősen befolyásolhatja a gátlási zóna átmérőket, így a rezisztencia viszonyok megítélését. Bognár Csaba 1988-ben készült diploma munkájában (3), összehasonlítva az inhibitor mentes Iso-Sensit agarat az akkor hazánkban rezisztencia vizsgálatra alkalmazott egyéb táptalajokkal, azt kapta, hogy nem volt lényeges különbség a vizsgált staphylococcusok és Gram-negatív baktériumok esetében a szulfonamid, trimethoprim és Sumetrolim érzékenysége között. A streptococcusok in vitro trimethoprim és Sumetrolim érzékenységét azonban az alkalmazott marhavéres táptalaj téves rezisztens irányba hamisította meg. Miután Magyarországon a rutin bakteriológiai laboratóriumok a tápigényes baktériumok in vitro rezisztencia vizsgálata során 5% marhavérrel kiegészített Mueller-Hinton táptalajt alkalmaznak, érthető módon a kapott érzékenységi adatok nem reálisak. Ezt felismerve az Országos Epidemiológiai Központ (volt OKI) által évente kiadott "fehér könyvben" már 1996-óta nem közölnek országos adatot a tenyésztésükhöz vért igénylő streptococcusok, Haemophilus, és enterococcusok Sumetrolim/trimethoprim érzékenységével kapcsolatban.
Jelen tanulmány célja az volt, hogy jól kontrollált körülmények között vizsgáljuk a hazai rutin gyakorlatban használt marhavér hatását a légúti patogének in vitro Sumertolim érzékenységére és a megfelelő in vitro körülmények biztosításával reális képet kapjunk ezen patogének valódi hazai érzékenységéről.
1998 augusztus 1 és december 31 között a SZOTE klinikáin fekvő betegek vizsgálati anyagaiból izolált 100 Haemophilus influenzae, 100 Streptococcus pneumoniae és 100 Moraxella catarrhalis törzs Sumetrolim érzékenységét vizsgáltuk. Ugyanazon betegtől párhuzamosan több alkalommal izolált törzs nem került feldolgozásra. A törzseket vagy azonnal felhasználtuk, vagy -70oC-on (Streptococcus pneumoniae esetében -20oC-on) tároltuk.
A rezisztencia vizsgálatokat Mueller-Hinton agáron (PasteurSanofi Code: 64 888) végeztük. A gyártó által megadott adatok alapján az agar megfelelően alacsony koncentrációban (<50 ng/l) tartalmaz thymidint. A táptalajt 5% marhavérrel, illetve 5% lizált lóvérrel egészítettük ki a Streptococcus pneumoniae esetében, illetve azonos mennyiségben alkalmazva csokoládé agarat készítettünk, amit kiegészítettünk 10 µg/ml NAD-dal a Haemophilus influenzae törzsek vizsgálatakor. Moraxella catarrhalis esetében vér nélküli Mueller-Hinton agáron, a táptalajt 5% marhavérrel, illetve 5% lizált lóvérrel kiegészítve is végeztük a rezisztencia vizsgálatot. A lóvér lizálása 24 órára -20oC-ra történő fagyasztással, majd azt követő olvasztással történt. A táptalajokat minden esetben párhuzamosan használtuk. A baktériumok tiszta, friss tenyészetéből készült MacFarland 0,5 sűrűségű szuszpenziót steril vattatamponos pálcával vittük fel a táptalajok felszínére és megfelelő inkubálás (szárítás után) helyeztük fel az Sumetrolim (Oxoid) korongokat, illetve a Sumertolim E-teszt csíkokat (AB BioDisk, Svédország). MIC érték meghatározás csak a lóvéres táptalajon történt. Kontrollként a Streptococcus pneumoniae ATCC 49649, a Haemo~philus influenzae ATCC 49766, a Moraxella catarrhalis ATCC 43617 és az Enterococcus faecalis ATCC 80171 törzseket használtuk. A MIC értékek és a gátlási zóna átmérők leolvasására 24 órás 37oC-on, 5% CO2 atmoszférában történő inkubálást követően került sor. A gátlási zónák átmérőjét mm pontossággal mértük.
A vizsgálatok egy későbbi szakaszában nagy gátlási zóna eltéréseket mutató válogatott izolátumok esetében vizsgáltuk különböző marhavér sarzsok hatását a gátlási zóna átmérőkre. A különböző sarzsból származó marhavért tartalmazó Mueller-Hinton agar táptalajok egy részéhez 0,4 IU/ml koncentrációban thymidin phosphorilase-t (Sigma) adtunk és vizsgálatuk hatását a gátlási zóna átmérőkre és a MIC értékre.
A Sumetrolim in vitro hatékonyságának értékelésekor az NCCLS 1998-as kiadványában megjelent gátlási zóna átmérőket és MIC értékeket vettük alapul (4) (1 táblázat). A párhuzamosan végzett korongdiffúziós módszer esetében csak az alaptáptalajt kiegészítő vérben volt különbség, mind az inkubációs idő, mind az inkubáció körülményei azonosak voltak. Mindhárom vizsgált species esetében jelentős eltérést találtunk a különböző táptalajokon. A referencia törzsek érzékenységi vizsgálatakor 7-16 mm-nyi, ill. 2-7 léptéknyi MIC különbséget észleltünk a marhavérrel ill. lizált lóvérrel kiegészített táptalajokon (2. táblázat). A klinikai vizsgálati mintákból származó törzsek esetében jelentősen magasabb százalékban voltak a törzsek érzékenyek a Sumetrolimmal szemben, ha a vizsgálatot lizált lóvért tartalmazó táptalajon végeztük (3. táblázat). A legnagyobb különbséget a S. pneumoniae esetében észleltük, amikor a marhavéres táptalajon a gátlási zóna alapján mindössze 6 törzs volt érzékeny kategóriába sorolható, míg a lóvéres táptalajon 65 törzs bizonyult érzékenynek. A lóvéres táptalajon mért MIC értékek alátámasztották a korongdiffúziós vizsgálat eredményét (4. táblázat). Mindössze a S. pneumoniae törzsek 12%-a, a H. influenzae törzsek 10%-a bizonyult rezisztensnek e vizsgálati körülmények között. A M. catarrhalis törzsek 2%-a volt rezisztens Sumetrolimmal szemben a lóvér tartalmú ill. vért nem tartalmazó Mueller-Hinton agáron. Az 5. táblázatban a jelen vizsgálatban korongdiffúziós módszerrel és MIC érték meghatározási módszerrel kapott érzékenységi adatokat összehasonlítottuk a nemzetközi irodalomban talált adatokkal, illetve az OEK által kiadott 1997-es országos adattal (7). A vizsgált lizált lóvéres táptalajon kapott eredmények jó egyezést mutatnak az Alexander projekt hat országban 1992-93 során gyűjtött >6000 légúti patogén vizsgálatával kapott Sumetrolim érzékenységi adatokkal, valamint Eliopous és Wennersten által 1997-ben közölt Sumetrolim érzékenységi adatokkal. Bár az OEK már 1996-óta nem közöl adatokat a S. pneumoniae és a Haemophilus törzsek Sumetrolim és trimetoprim érzékenységére vonatkozóan felismerve azt, hogy a hazai laboratóriumok nem megfelelően standardizált körülmények között végzik ezeket a vizsgálatokat, a M. catarrhalis esetében közölt országos adatok jelentős eltérést mutatnak nemcsak a nemzetközi adatokhoz viszonyítva, de a jelen vizsgálatban kapott érzékenységi adatokhoz képest is. Ennek oka feltehetően egyrészt az, hogy bár a M. catarrhalis esetében nem lenne szükség véres táptalaj használtára a rezisztencia vizsgálat során, a laboratóriumok egy része vérrel kiegészített Mueller-Hinton táptalajon végzi a meghatározást, de lehet oka az is, hogy a hazai mikrobiológiai laboratóriumok egy része még mindig nem kellő mértékben kontrollált, megbízhatóan alacsony thymin-thymidin koncentrációjú gyári portáptalajból készíti a rezisztencia vizsgálat során használt Mueller-Hinton táptalajt. Vizsgálatainkban a nagy gátlási zónabeli eltérést mutató törzseknél különböző marhavér sarzsokkal kiegészített Mueller Hinton táptalajokon végzett rezisztencia meghatározás azt mutatta, hogy az egyes marhavér sarzsok Sumetrolim érzékenység meghatározást befolyásoló thymidin koncentrációja lényeges különbséget mutatnak. Így ugyanazon törzs Sumetrolim gátlási zónája két különböző marhavér sarzzsal kiegészített, azonos Mueller-Hinton agar esetében akár 10-15 mm különbséget is mutathat. A 0,4 IU/ml thymidin phophorilase kiegészítése a táptalajnak nem segített a táptalaj minőségének standardizálásában.
Javaslat a laboratóriumok számára a H. influenzae, S. pneumoniae és M. catarrhalis izolátumok in vitro Sumetrolim érzékenységi vizsgálatára.
H. influenzae törzsek esetében az NCCLS a HTM (Haemophilus Test Medium) agartáptalajt, amely vér hozzáadása nélkül készül, ajánlja az antibiotikumok rezisztencia vizsgálatára. Ez a táptalaj napjainkban már a hazai kereskedelmi forgalomból is beszerezhető. A referencia H. influenzae törzs gátlási zónájának átmérője, ill. MIC értéke a lizált lóvérrel kiegészített táptalajon mérttel közel megegyezik, tehát a thymidin koncentráció megfelelően alacsony szintje biztosított.
A M. catarrhalis törzsek megbízható co-trimoxazol érzékenységet mutatnak a vér kiegészítés nélküli, kereskedelmi forgalomból beszerezhető Mueller-Hinton agartáptalajon és a HTM agaron.
A S. pneumoniae törzsek érzékeny, tápigényes baktériumok, amelyek növekedéséhez szükséges az agartáptalaj vérrel történő kiegészítése. Hazai viszonylatban a lóvérrel történő kiegészítés nem biztosított folyamatosan a rutin bakteriológiai laboratóriumok számára. Kereskedelmi forgalomból beszerezhetőek olyan Mueller-Hinton táptalajok, melyek megfelelően alacsony thymidin koncentrációját (<50 ng/l) a gyártó garantálja. A marhavérben lévő változó, néha a vizsgálat eredményét jelentősen befolyásoló magas thymidin koncentráció azonban zavarhatja a rezisztencia vizsgálat helyes eredményét, ezért naponta ajánlott kontrollálni, ismert gátlási zónájú referencia törzzsel (az Enterococcus faecalis ATCC 29212 vagy ATCG 33186 jelzésű törzs) a táptalaj alkalmazhatóságát. A megfelelően alacsony thymidin koncentráció bizonyítéka, ha a legalább 20 mm átmérőjű, tiszta gátlási zónában mikrotelepek sem láthatóak.
Koch EA, Burchall J: Reversal of the antimicrobial activity of trimetoprim by thymidine in commercially prepared media Appl Microbiol 1971; 22: 812
Harper GJ, Cawston WC: The in vitro determination of the sulphonamide sensitivity of bacteria J Path Bact 1945; 57: 59
Bognár Cs: Sulfonamid és trimetoprim antagonisták hatása a streptococcusok Sumetrolim érzékenységére Diplomamunka 1988. Budapest
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 1998. Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters. National Committee for Clinical Laboratory Standards Villanova, Pa.
Grüneberg RN: The Alexander Project: using in-vitro susceptibility data for choosing empirical therapy in LRTI J Antimicob Chemother 1996; 38: (Suppl A) 155
Eliopoulos GM, Wennersten CB: In vitro activity of trimethoprim alone compared with trimethoprim-sulfamethoxazole and other antimicrobials against bacterial species associated with upper respiratory tract infections Diagn Microbiol Infect Dis 1997; 28: 33
Az Állami Népegészségügyi és Tisztiorvosi Szolgálat valamint az Egyetemek és Kórházak 1997 évi járványügyi-klinikai-kóházhigiénés mikrobiológiai munkájának értékelése. Johan Béla Országos Közegészségügyi Intézet (1997)
* Levélcím: Dósa Erika
Szentgyörgyi Albert Orvostudományi Egyetem
6725 Szeged, Somogyi Béla tér 1
6701 Szeged, Pf.: 482.