A DNS biochipen nagy sűrűségben szilárd hordozóhoz kötött specifikus, a vizsgált szekvenciával komplemeter próbák találhatók, melyek lehetnek rövid szintetikus oligonukleotidok, vagy hosszú DNS-szálak. A chipen történő egyetlen hibridizációval információt kaphatunk több ezer RNS, jelenlétéről, mutációról, polimorfizmusról. A transzkripciós kép ismeretében lehetővé válik többek között mikroorganizmusok, vagy szövetek adott állapotára jellemző több ezer gén kifejeződésének monitorozása, új biokémiai utak felderítése, gyógyszerek hatásmechanizmusainak nyomon követése, fiziológiailag eltérő állapotokért (pl. betegség esetén) felelős gének felfedezése.
Különböző betegségekre jellemző transzkripciós mintázat diagnosztikai jelentőséggel bírhat a betegségek osztályozásában. Génamplifikációs technikákkal kombinálva a chip technika alkalmas kórokozók azonosítására, fiziológiai jellegzetességeinek (pl. kemoterápikumokkal szembeni rezisztencia) gyors és érzékeny detektálására. A nagy hatékonyságú és gyors DNS-chip alapú mutáció analízis felhasználható lesz a prenatális és orvosi diagnosztika különböző területein is. Az előadás ennek az új technikának alkalmazási lehetőségeit foglalja össze a nukleinsav alapú molekuláris diagnosztikában.
Az öröklött betegségek hátterében álló genetikai elváltozások kimutatása kétféle megközelítést igényel. Az első a már régebb óta ismert módszerekkel (restrikciós emésztés, allélspecifikus oligonukleotid hibridizáció, allélspecifikus PCR) a ritka, súlyos fenotípust okozó mutációk kimutatása. A gyakoribb, esetlegesen betegség-asszociált eltérések detektálására, mivel ebben az esetben mindig nagyobb populáció vizsgálata indokolt, nagy fejlődés tapasztalható új módszerek kialakítása terén. Ezek a módszerek, a detektálás hidrolízis próbával, az ún. "molecular beacon" és a hibridizációs próbával történő detektálás már mind fluoreszcens kumutatást alkalmaznak, ami lehetővé teszi az agaróz gél ill. membrán alapú módszerek, kiváltását. A hibridizációs próbákkal történő allél kimutatása fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) és a lágyulási hőmérséklet különbség elvén alapul. A rendszerben két hibridizációs oligonukleotid van. Az első, ún. detektáló próba (amely áltatában vad típus specifikus) a mutáció helyére tervezett és a 3' végén fluoreszceinnel jelölt. A második ún. anchor próba tőle 3' irányba, közvetlenül mellé tervezett. Ez a próba 5' végén van jelölve fluoreszcens festékkel (LCRed640). Ha mindkét próba hibridizál a templáthoz, létrejön a FRET, azaz a gerjesztéskor a detektáló próba az alapállapotba úgy tér vissza, hogy gerjesztési energiáját átadja az LCRed640-nek, így annak megfelelő szignál keletkezik. Ez lehetővé teszi a PCR valós idejű követését, valamint azt, hogy a PCR utáni lassú hevítéskor megállapítsuk a minta lágyulási hőmérsékletét. Ha a detektáló próba vad típusú szállal alkot hibridet, az lényegesen stabilabb, mint a detektáló próba-mutáns templát hibrid, ezáltal a lágyulási hőmérséklet különbségekből a genotípus meghatározható.
A molekuláris genetikai módszerek egyre fontosabb szerepet játszanak a lymphoid malignitások vizsgálatában. A B-, valamint a T-sejt differenciálódás korai stádiumában végbemegy az immunglobulin nehézlánc (IgH) ill. a T-sejt receptor g (TCRg) génátrendeződés, ami közel minden B- és T-sejtben kimutatható, ezért a lymphoid sejtproliferáció specifikus klonális markerének tekinthető. Az akut lymphoblastos leukémiákban (ALL) az IgH és TCRg génátrendeződés vizsgálatának a minimális reziduális betegség (MRD) kimutatásában van legnagyobb jelentősége. A diagnózis felállításakor akkor lehet rá szükség, amikor a nagyon éretlen vagy kisszámú blastos populáció miatt a morfológiai illetve immunfenotípusos beosztás bizonytalan.
A genomiális DNS-ben lévő variábilis (VH), diverzitás (DH), kapcsolódási (JH) és konstans (C) génszakaszok rekombinálódásával alakul ki az IgH gén. A TCRg génátrendeződése során Vg, Jg és C génszakaszok kapcsolódnak egymáshoz. A genomiális V, (D), J gének lehetséges magas száma, valamint ezen gének kapcsolódásakor beékelődő nukleotid addíciók teszik egyedivé minden B-sejt IgH ill. minden T-sejt TCRg gén szekvenciáját. Emiatt reaktív folyamatokban minden egyes B- ill. T-sejt más-más szekvenciájú és hosszúságú gént hordoz, míg lymphoproliferatív betegségekben a tumorsejtek azonos génátrendeződéssel, azonos hosszúságú génnel rendelkeznek.
Az IgH és TCRg génátrendeződés kimutatása során polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk az adott génszakaszt. A keletkezett termékeket poliakrilamid gél elektroforézissel választjuk szét.
Diagnosztizált ALL-es és CLL-es esetekben vizsgáltuk az IgH ill. TCRg génátrendeződést. 30 esetből 24-ben kimutatható volt a klonalitás, 6 esetben nem. A klonalitás igazolhatósága esetén a vizsgálat jól alkalmazható a MRD kimutatására.
Háttér: Az öröklődő hemokromatózis (HH) a vasmetabolizmus autoszomális recesszív betegsége. Génjét (HFE) a 6-os kromoszómára lokalizálták, és nemrégen azonosították pozicionális klónozással. A klinikai tünetek alapján diagnosztizált betegek 64-100%-ában a HFE gén egyik pontmutációja (C282Y) homozigóta formában mutatható ki. A gén másik pontmutációjának (H63D) kapcsolata a vasfelhalmozódás kialakulásával vitatott. Bár a hemokromatózis az európai eredetű népek egyik leggyakoribb öröklődő betegsége, specifikus tünetek hiányában mégis ritkán diagnosztizálják. Célkitűzés: (i) Pontosabb epidemiológiai adatokat nyerni Magyarország vonatkozásában a HFE génre vonatkozóan. (ii) A molekuláris vizsgálat kísérleti alkalmazása a rutin diagnosztikában. Eredmények: A C282Y pontmutáció allélfrekvenciáját 1271, a H63D allélfrekvenciáját 277 véletlenszerűen kiválasztott, rokoni kapcsolatban nem álló, egészséges egyénnél határoztuk meg PCR-RFLP (RsaI, BcII) analízissel. A C282Y-allélfrekvencia 3,8%, a H63D-allélfrekvencia pedig 12,3% volt. A HH klinikai gyanúja miatt 340 betegnél végeztünk mutáció-analízist, és 28 C282Y-homozigótát illetve 48 C282Y-heterozigótát azonosítottunk. A 28 homozigóta közül 13 esetben álltak rendelkezésre klinikai adatok: májbiopszia pozitivitás 9/9, transzferrin szaturáció pozitivitás 10/13, ferritin pozitivitás 8/10 esetben állt fenn. Következtetés: A normál hazai populációban megfigyelt C282Y és H63D allélfrekvenciák megfelelnek más európai országokban talált értékeknek. A HH Magyarországon is igen gyakori, a C282Y-allélfrekvencia alapján körülbelül minden hétszázadik férfi homozigóta. A mutációanalízis egy új, a klinikai gyakorlatba egyre inkább beépülő, nem-invazív módszer a HH diagnosztikájában.