Because of the high concentration of urea, Fossati's method for total bilirubin was modified. The aim of the modification was to eliminate the urea carry-over in automated analyzers. This drawback was overcome. Occasional urea (and ammonium) contamination of the modified reagent proved to be minimal, the carry-over was of not significance, the urea assay was not disturbed by the bilirubin reagent. The modified reagent can be applied both to automated and manual assays. The stability of the ready reagent solution is good, it can be stored for up to 2 weeks refrigerated. Fossati's "direct" bilirubin reagent prepared by Reanal was studied as follows. The extent of the coupling reaction with unconjugated standards (freshly dissolved, as well as stored refrigerated) was compared with other methods, first of all with the original Jendrassik-Gróf "red" method, besides the rate of the "direct" bilirubin reaction was examined using different controls and patient samples. These results show the significance of determining and keeping the reaction time when assaying "direct" bilirubin. The autors stress that "direct" and "conjugated" bilirubin are not identifical concepts, they cannot be substitued for each other.
A referencia módszerként ajánlott Jendrassik - Gróf "kék" eljárás egyedüli hátránya, hogy több reagenses módszer, valamint az azo-származék képzéséhez szükséges diazotált szulfanilsav (szulfofenildiazóniumsó) eltarthatósága rövid idejű (1,2).
Fossati és munkatársai (3,4) a Jendrassik - Gróf (J-G) módszer savas változatát módosítva az összbilirubin meghatározására koffeinen kívül jelentős koncentrációban karbamidot is használtak; a savas közeget sósavval és nagy koncentrációban használt citromsavval biztosították. Lényegében a direkt bilirubin meghatározásánál a savas közeget hasonlóképpen hozták létre. A nagy koncentrációjú citromsav és tenzid használata a direkt bilirubin meghatározásánál eredményesen meggátolta a zavarosság kialakulását (fehérje kicsapódását); az összbilirubin esetében ezt a hatást még a karbamid is elősegítette.
A Fossati féle módosítást egy reagenses, automatára adaptálható módszerként értékelve, felmerült a megvalósítás előtt az összbilirubin reagens nagy karbamid koncentrációjának valamilyen más anyaggal történő kiváltása, a karbamid meghatározását zavaró esetleges carry-over miatt.
A karbamid sikeres kiváltása, valamint a direkt bilirubin reagens reakció körülményeinek vizsgálata, ennek eredménye a részletes részben található.
Jendrassik - Gróf (J-G);
Reanal - Fossati direkt bilirubin reagens (R-F);
Módosított savas összbilirubin módszer,
Reanal - Fossati -Jendrassik - Gróf (R-J-G);
Össz bilirubin: TB;
Direkt bilirubin: DB;
2,4-diklórfenil-diazóniumsó:
DCA 2,5-diklórfenil-diazóniumsó: DPD
a karbamid helyettesítésére használt guanidiniumkloridot tartalmazó reagens esetleges karbamid és ammónium ion szennyeződésének, valamint a reagens karbamid meghatározást esetleges zavaró hatása,
a módszer linearitása és reprodukálhatósága,
a színreakció kialakulása, kémiai automatán is,
a kész reagens eltarthatóságának megállapítása.
A guanidiniumklorid tartalmú reagens karbamid és ammónium szennyeződése, valamint az UV karbamid meghatározásra gyakorolt hatásának vizsgálatára a R-J-G összbilirubin reagenshez azonos térfogatú ionmentes vizet, illetve vizes karbamid standard (20 mmol/L) oldatot mértünk. A kontroll érdekében a karbamid vizes standardot is azonos térfogatú ionmentes vízzel hígítottuk. A méréseredmények egyértelműen bizonyították, hogy a vizsgált R-J-G reagens karbamid (és ammónium-ion) koncentrációja jelentéktelen (6 mmol/L alatti), továbbá, hogy maga a reagens anyaga, a karbamid standarddal hígított reagenst mintaként használva, az UV karbamid meghatározást nem zavarja. A mérést HITACHI 704 automatán, 37°C-on végeztük.
A módszer (R-J-G) szórását nagykoncentrációjú betegsavó, valamint Reanal bilirubin albuminos standard hígítási sorával vizsgáltuk. A bilirubin standard hígítási sorát linearitás vizsgálatára is felhasználtuk. Mérés HITACHI 704 automatán, 37°C-on. A reakcióelegy/minta arány 36 volt, ez jelentős mintahígulást jelent. A szórás és a linearitás kedvező (1. és 2. táblázat).
|
1. táblázat R-J-G módosított összbilirubin reagenssel szórásvizsgálat. HITACHI 704 V/v=36
|
|
2. táblázat Reanal bilirubin standard hígítási sor (1. táblázat) linearitás vizsgálata.
|
Más (DCA) módszerrel összehasonlítva, igen jó a korreláció a két eljárás között. Példaként: másik automatán (Olympus) a két reagenses DCA módszerrel mért, 8 különféle betegsavó felhasználásával a regresszió paraméterei, x = Olympus, DCA; y =HITACHI, R-J-G módszer (3. táblázat).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mind az össz, mind a direkt bilirubin reagense (R-J-G), illetve (R-F) esetében, a nitrit bemérése után +6°C-on tárolva 12 napon át, a reagensek kifogástalanul működtek.
37°C-on a R-J-G reagenssel 6 pere alatt a színreakció gyakorlatilag teljesen végbemegy; ezután mérsékelt emelkedés figyelhető meg, ami automatával végzett elemzésnél a fix reakcióidő miatt már nem zavar. Ugyanakkor, manuálisan szobahőmérsékleten végzett vizsgálatnál ez az idő 10 percre veendő; ekkorra szintén teljessé válik a reakció. További mérsékelt emelkedés a mérési idő elcsúszása esetében már jelentéktelen hibát okoz. Példaként: a nagy koncentrációjú Olympus Level 2 kontroll esetében, a R-J-G módszerrel, a minta vakkal szemben, 1,00 cm-en, a Hg 578 nm-en, 11 perc reakció idő után az abszorbancia 0,322 volt; ez az érték további egy óra szobahőmérsékleten történő állás után 0,334-re emelkedett; ami 3,7 %-os emelkedést jelentett. (A Level 2 deklarált összbilirubin koncentráció átlaga, Jendrassik - Gróf szerint: 109; a DCA módszerrel 114 mmol/L). A manuális mérésnél a V/v arány = 21 volt, azaz 2,00 mL reagensbe 0,100 mL mintát mértünk.
A 350-es faktor alapján a Level 2 bilirubin koncentrációja 11 perces inkubáció után 112,7; míg további 60 perces inkubáció után 116,9 umol/L értékűnek adódott.
A karbamid helyettesítésével sikerült a várható carry-over veszélyt kiküszöbölnünk, ugyanakkor megtartottuk az összbilirubin meghatározás Fossati szerinti módosítás előnyeit: stabil egy reagenses módszer, mind manuális, mind automata alkalmazásra teljesen megfelel. A két reagens oldat jót tárolható, igen hosszú ideig (egy évet is meghaladóan); ugyanakkor a két oldat megfelelő arányú keverékével egyszerűen elkészíthető reagens hűtve - eddigi tapasztalataink szerint - két hétig is tárolható.
Nincs "direkt" bilirubin standard.
A nem konjugált (gyári) bilirubin albuminos standard csak az összbilirubin módszer illesztésére használható.
A "direkt" bilirubin reagensek mind a koncentráció és ezzel a törésmutató, mind a pH tekintetében nem azonosak az összbilirubin reagens ezen jellemzőivel!
Egyértelműen nem határozható meg a "direkt" bilirubin fogalma!
További problémát jelent, hogy a "direkt" bilirubin reakciókészsége a különböző mintáknál eltérő lehet. Vonatkozik ez a kontrollokra és a standardokra (kalibrátorokra) is.
A "direkt" bilirubin a "gyorsító" nélküli bilirubin reagenssel reagáló bilirubin frakciót jelenti, de ez a reakcióképesség nem jelenti a konjugált és nem konjugált bilirubinok definíciószerű elkülönítését. (A többesszám használatával utalunk a mono-, dikonjugált formák, valamint a nem konjugált forma keverékére, a konjugált kifejezés sem határozza meg, hogy mivel konjugálódott a bilirubin). A nem konjugált forma esetében is felmerül a különböző térbeli izomerek jelenléte, a "vízoldhatatlan" Z-Z formától a Z-E; E-Z és a jól oldódó E-E formáig (5,6).
A hozzáférhető bilirubin standard nem konjugált; megfelelően készített albuminos oldata használható az összbilirubin módszer kalibrálására.
Vizsgálataink szerint is módszertől és más tényezőktől függően, a nem konjugált bilirubin képes többé-kevésbé reagálni a "direkt" bilirubin reagensekkel (6).
Ugyanakkor az oldott bilirubin standard "direkt bilirubin" meghatározásában az oldás óta eltelt időtől függően, koncentráció-emelkedést mutat.
A referencia módszerként is ajánlott Jendrassik-Gróf módszer "direkt" bilirubin meghatározása használatos a standard, kontroll "direkt" bilirubin koncentrációjának deklarálására. Ezenkívül ettől eltérő esetekkel is találkozhatunk, amikor valamilyen más módszerrel (DCA; DPD) meghatározott "direkt" bilirubin koncentrációja eltér a Jendrassik Gróf módszerrel mérttől. (Pl: az általunk is használt Olympus control serum level 2 esetében).
A nem konjugált albuminos bilirubin standard friss oldása, majd sötétben, hűtve tárolva, két hét után a Fossati féle "direkt" bilirubin reagenssel (R-F), szobahőmérsékleten mérve, 1,00 em-es küvettában, Hg 578 nm-en, 3,00 mL reagenshez 0,100 mL minta mérésével, a reakcióidő függésében az alábbi koncentráció adatokat kaptuk. (Faktor: 512). Egyidejűleg azonos feltételekkel végzett összbilirubin meghatározás eredményét is közöljük (4. táblázat).
|
4. táblázat Koncentrációk mmol/L-ben.
|
A "direkt reagáló" bilirubin koncentációja két hét állás alatt jelentősen, mintegy 50 %-kal megemelkedett.
A reakció időtől függő, "direkt" bilirubin koncentráció emelkedését, a nem konjugált bilirubin albuminos standard esetében az eredeti Jendrassik-Gróf "piros" módszerrel is megfigyeltük. A vizsgálatot 37°C-on, 1,00 cm-es küvettában 546 nm-en, V/v = 6,5 reakcióelegy/minta aránnyal végeztük. A bilirubin albuminos standard névleges koncentrációja 113 mmol/L (5. táblázat).
|
||||||||||||||||||||||||||||||
A "direkt" bilirubin referencia koncentráció meghatározásához ajánlott reakcióidő: szobahőmérsékleten (22°C körül) 5 perc; 37°C-on 2 perc (3).
Ennek alapja megállapodás; a mérési eredmény nem jelenti a konjugált bilirubin tényleges koncentrációját.
Fenti, nem konjugált albuminos bilirubin standard "direkt" bilirubin koncentrációjának meghatározása, három módszerrel, 37°C-on mérve, 5 perc inkubáció után, a 113 mmol/L összbilirubin koncentráció %-ában.
|
a./ DCA módszer |
b./ Reanal Fossati |
c./ Jendrassik-Gróf "piros" |
|
22,3% |
11,3% |
19,5% |
A névleges 113 mmol/L korcentrációjú albuminos bilirubin standardot Jendrassik-Gróf "kék" módszerével meghatározva, 107 mmol/L koncentrációjúnak találtuk
Összbilirubin: 1,00 mL minta; 2,00 mL koffein keverék; 0,50 mL, diazo-keverék. Térfogat kiegészítés 1,50 mL fiz. sóoldattal. Esetünkben a térfogatot deszt. vízzel 10 mL-re egészítettük ki. Minta: gyűjtött savó. pH : 5,90
"Direkt" bilirubin: kivitel: Összbilirubin szerint, de a 2,00 mL, koffein keverék helyett 2,00 mL fiziológiás sóoldat mérendő be. pH : 3,5
A pH eltolódás befolyásolja a színreakciót; a savasabb közeg az elnyelési maximumot a nagyobb hullámhosszak felé tolja el. (Ugyanez vonatkozik a lúgos irányú pH eltolódásra is. lásd a Jendrassik-Gróf "kék" módszerét is!) Az abszorpciós maximum eltolódása miatt valójában a mérés hullámhosszától is függő faktort kellene megállapítani, ami a megfelelő "direkt" bilirubin standard hiányában nem oldható meg. Ezért szükséges a mérés körülményeire vonatkozó megállapodás; kiemelve. hogy a kapott eredmény nem azonos a konjugált bilirubin koncentrációjával. Az így meghatározott "direkt" bilirubin koncentráció csak megegyezés alapján nyert érték; nem jelenti az összes konjugált bilirubin koncentrációját (1,6,7). A reakció időtartamával együtt növekvő abszorbancia emelkedést rendszeresen észleltük a "direkt" bilirubin meghatározásban.
Vizsgálataink során különféle kontrollok, kalibrátor, erősen ikteruszos minták esetében ezt az emelkedést rendszeresen mértük; ugyanakkor találkoztunk olyan kontrollal is, amelynél a "direkt" bilirubin koncentráció aránylag hamar megközelített egy határértéket (Level 1).
Jendrassik-Gróf, "piros", két reagenses módszerével direkt bilirubin meghatározás, 5 perc reakcióidő alapján "Calibrator"-ral kalibrálva. Névleges "direkt" bilirubin koncentráció: 38,5 mmol/L. A reakció csak a 16. mérési ponttól értékelhető; ez előtt méri be az R2-őt a készülék. A meghatározás jellemzői: 2 reagenses módszer; minta: 20; R1: 350; R2: 50 mL. Első mérési pont: 15; második: 32. Mérési segédhullámhossz: 700 nm; főhullámhossz: 546 nm. Mérés: minta vakkal (14-15 mérési pont átlagával, térfogat-korrekcióval) szemben.
A "direkt" bilirubin meghatározásához a Jendrassik-Gróf "piros" módszer reagensei: R1 = fiziológiás sóoldat; R2 = 10 mL sósavas szulfanilsav oldat (Diazo-I) és 0,25 mL 0,5 %-os nátrium-nitrit oldat (Diazo-II) frissen készült, hűtött keveréke. A Diazo I oldat készítése: 5 g szulfanilsav; 15 mL 37 %-os sósav deszt. vízzel 1 literre töltendő fel. Az oldódást melegítéssel segítjük elő.
A Jendrassik-Gróf eljárás az összbilirubin meghatározásához a fiziológiás sóoldat helyett "koffein keveréket" használ. Készítése (eredeti recept 20 g koffein; 30 g nátrium-benzoát és 50 g kristályos (3 H2O) nátrium-acetát deszt. vízzel 400 mL-re oldandó. Gépi felhasználás esetében ezt az oldatot azonos térfogatú deszt. vízzel hígítva használjuk. HITACHI 704-en egyébként a bemérési és mérési adatok az e módszerrel történő összbilirubin meghatározására azonosak a direkt bilirubinnál leírtakkal, azzal, hogy az R1 jelen esetben nem fiziológiás sóoldat, hanem a fentiek szerint hígított "koffein keverék".
A reakcióidő jelentőségét, mind a kalibráció, mind a minták vizsgálata szempontjából az alábbi összeállítás bizonyítja, HITACHI704 készülékkel, 37°C-on mérve:
A két perces reakció (7.-8. mérési pont átlaga) eredményét 100 %-nak véve; az összbilirubin meghatározásánál a 10 perces reakció 106 - 108 %-os koncentrációt eredményezett, mind Calibrator, mind a Level 1 és 2 esetében; ugyanakkor a "direkt" Reanal Fossati esetében a színreakció változatosan alakul ki:
A 130 s értékéhez, mint 100 %-hoz képest a 10 perces érték alakulása:
|
Calibratornál: |
Level 1 esetében: |
Level 2 esetében: |
|
126% |
106% |
346% |
A Level 2 esetében az emelkedés folyamatosan figyelhető meg.
A direkt reakció időbeli lefolyása mintánként eltérő lehet. Az alábbi példákkal kívánjuk ezt bizonyítani.
Kísérlet: HITACHI 704, 37°C; V/v = 36; mérés fő hullámhossza: 570 nm. A kinyomtatott mérési adatokból a kalibráció adatai alapján számítottuk ki az egyes időpontra jellemző koncentrációkat. Ugyanúgy, mint a készülék, 2 egymás melletti pont abszorbancia átlagából számoltunk; a faktorálásra Roche Calibrator-t használtunk, 5, illetve 2 perc reakcióidővel. A kiértékeléshez az alábbi mérési pontok átlagát használtuk: 7., és 8.; 14. és 15.; valamint a 31. és 32. pontokét, melyek 130; 265 és 600 s reakció időtartamnak felelnek meg (6. táblázat).
|
6. táblázat Direkt bilirubin reakció lefolyása, Reanal-Fossati féle módszerrel
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Megjegyzés a Level 1 és 2, valamint a 1002. minta esetében a mérési pontokat a 6. és 7. pont átlagára azaz 110 s reakcióidőre állítottuk be. Így a HITACHI által kinyomtatott Level 1 eredménye 22,0; a Level 2-é 7,0; az 1002. mintáé 176,6 direkt bilirubin, mmol/L. A 6. táblázat 130 s-on mért koncentrációit, mint alapot, 100 %-nak véve a 265 és 600 s-os adatok %-ban kifejezve jellemzik a "direkt" reakció változó lefolyását (7. táblázat).
|
7. táblázat
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A táblázat egyértelműen kimutatja, hogy egy adott kalibrátor adott reakcióidő alatt elért abszorbanciája, mint a faktorálás alapja még azonos reakcióidő esetében is mintánként eltérő eredményt okozhat. Ezt bizonyítjuk az alábbi összeállítással (8. táblázat). Felhasznált adatok: a 6. táblázat új kalibrálás részéből az azonos reakcióidejű kalibrátor értékével osztjuk a megfelelő reakcióidejű minta értékét, rendre a 130s; a 265 s és a 600 s mérésadatok alapján.
|
8. táblázat
|
Összehasonlító mérések; a Jendrassik-Gróf össz- és direkt bilirubin módszerrel. HITACHI 704 készüléken.
E két reagenses módszer gyakorlatilag maximálisan 5 perc 24 s reakcióidő alkalmazását teszi lehetővé. Így a 22.-23.; valamint a 31.-32. mérési pont átlagából számoltunk. Ez az egy reagenses módszerek esetében a 7.-8., valamint a 16.-17. mérési pont átlagának felel meg a reakció időtartamát tekintve. A két reagenses módszer esetében a 14.-15. mérési pont átlaga, mint minta vak szerepel; természetesen a reakció-elegy térfogat-növekedése arányával korrigáltan. A kiszámolt adatokat a 9. táblázat tartalmazza:
A "direkt" reakció jelentős időbeli emelkedése itt is megfigyelhető; kivétel a Level 1 stabilnak mondható "direkt" reakciója, ugyanúgy, mint az előző, Reanal-Fossati módszer esetében. Az igen kis "direkt" bilirubin koncentrációjú Level 2 esetében a %-os aránytól nagyobb pontosságot nem várhatunk; de az eredmény hasonló, mint a Reanal-Fossati módszer esetében. Lásd a 7. táblázatban.
|
9. táblázat Jendrassik-Gróf, "piros" módszer. Koncentrációk mmol/L-ben.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A Reanal-Jendrassik-Gróf (módosított Fossati) összbilirubin reakcióidőbeli emelkedését, a 7.-8. mérési pont átlagát, 100 %-nak véve; a 16-17; 22-23 és a 31-32 mérési pontok átlagából számoltan (reakcióidők rendre: 130 s; 305 s; 42 s és 600 s), a 10. táblázatban tüntettük fel.
|
10. táblázat Összbilirubin;
Reanal-Jendrassik-Gróf (mód. Fossati)
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Összevetve a Jendrassik-Gróf "piros" módszerével kapott összbilirubin koncentráció alakulását, a 130 s és 305 s reakcióidő viszonylatában, megállapítható, hogy a Reanal Jendrassik-Gróf (módosított Fossati) módszer jól összehasonlítható, hasonló reakció-alakulást mutat. Ugyancsak megállapítható, hogy 37°C-on az összbilirubin meghatározáshoz elégséges a 425 s-os reakció idő, ami gyakorlatilag alig több 7 percnél. Így 8 perc reakcióidő elegendő.
Továbbra is megállapodás lehet az alapja a "direkt" bilirubin kalibrálásánál és mérésénél használandó reakció időtartamnak; HITACHI 704 (és 705) esetében. 37°C-on, a 130 s-os reakcióidőt az említett készülékeknél a programba a 8. mérési pont beírásával adhatjuk meg. Ekkor a 7.-8. mérési pont átlageredményéből számol a processzor.
A Reanal-Jendrassik-Gróf, módosított Fossati összbilirubin meghatározás reagensei jól tárolhatók: a reagens ezekből egyszerűen készíthető el. A kész reagens hűtve - eddigi tapasztalataink szerint - két hétig is tárolható. Mint egy reagenses módszer, nagyobb bemérési pontosságot eredményez, mint a két, vagy három reagenses eljárások. A módszer reprodukálhatóságát, linearitását és más módszerrel a korrelációt, regressziót vizsgálva kifogástalannak bizonyult. Automatára egyszerűen alkalmazható, a karbamid meghatározásánál carry-over veszélyt nem jelent. Manuális módszerként is kiváló.
A Fossati szerinti "direkt" bilirubin Reanal által kiszerelt reagensét vizsgálva megállapítottuk, hogy a módszer az adott körülmények között a nem konjugált bilirubinnal kisebb mértékben reagál, mint a Jendrassik-Gróf eredeti "piros" módszere, valamint egy általunk vizsgált másik cég DCA-t használó reagense. Vizsgáltuk a "direkt" bilirubin reakció időbeli lefolyását, manuálisan és HITACHI 704 automatán, 37°C-on, különböző kontrollok, kalibrátor és ikteruszos betegsavók használatával. Néhány anyagnál összehasonlító mérést is elvégeztünk, Jendrassik-Gróf "piros" módszerével. Megállapítottuk, hogy a "direkt" bilirubin színreakciója a mérés időtartama alatt általában folyamatosan növekvő intenzitású volt. E növekedés meredeksége azonban esetenként a többiekétől igen eltérő lehet. A széttartó görbék miatt döntő, hogy az adott hőmérsékleten mekkora reakcióidőt használunk, mekkora reakcióidőre programozzuk készülékünket. Ugyanis egy választott reakcióidő alatt a kalibrátorunk abszorbanciájához képest a vizsgált mintánk abszorbancia aránya egy másik választott reakcióidő használatánál jelentősen megváltozhat. Ritkán előfordulhat, hogy a minta "direkt" bilirubinjának színreakciója aránylag rövid idő alatt állandósul. Így különböző mérési időpontok használatánál az emelkedő színreakciójú kalibrátorral szemben e minta állandósult abszorbanciája látszólagos "direkt" bilirubin csökkenést mutathat.Vizsgálatainkban mindkét esetre találtunk példát, mégpedig az Olympus Level 1 és Level 2 kontrollja esetében. A Level 1 "direkt" bilirubin színreakciója hamar állandósult, ezzel szemben a Level 2-é folyamatosan, intenzíven növekedő volt. Így, ha a "direkt" bilirubin mérési idejét az automatán 5 percre programoztuk, a Level 2 öt perc reakció idővel mérve megadta a 7,5 mmol/L "direkt" bilirubin koncentrációt; ugyanezen mérés 2 perces (130 s-os) mérési pontjánál az eredmény csak 2,1 mmol/L-nek adódott (9. táblázat).
Mindezekből következik: a "direkt" bilirubin reakcióidejét pontosan meg kell határozni. Fossati szerint 37 °C-on két perc; szobahőmérsékleten 5 perc a választandó idő. Az eredményt még befolyásolhatja eltérő kalibrátorok használata, ami a laboratóriumok között a körkísérleteknél további eltérést okozhat. A "direkt" bilirubin reakcióban a nem konjugált bilirubin kismértékben vesz részt, ugyanakkor a különböző konjugáltságú (mono-és dikonjugált) bilirubinok valamint a fehérjékhez különösen nagy erővel kötődő delta-bilirubin eltérő reakciósebességgel alakítják ki színreakciójukat. Mindezekért: a "direkt" bilirubin csoport nem azonos a konjugált bilirubin csoporttal, helytelen tehát a "direkt" reakció eredményét konjugált bilirubinként megnevezni! Az indirekt bilirubinban részes még a reakcióidő alatt nem reagált konjugált bilirubin is! Valójában a "direkt" bilirubin tényleges koncentrációját a mérési idő deklarálásával nem tudjuk egyértelműen meghatározni; de azt sem, hogy meddig "direkt" reagálásúak a vizsgált mintánk bilirubinjai.
Megállapíthatjuk, hogy:
A Reanal-Jendrassik-Gróf (módosított Fossati) módszer, mint egy reagenses eljárás, jól adaptálható laboratóriumi kémiai automatákra; mind összbilirubin; mind direkt bilirubin meghatározására.
A 37°C-on a javasolt reakcióidő összbilirubin vizsgálatakor: 8-10 perc; direkt bilirubin esetében: 2-2,5 perc (125-150 s). Mérési hullámhossz: 570 nm; (570-580 nm között)
Manuális kivitelnél az ajánlott hullámhossz, mint az automatáknál; célszerű a Hg 578 nm-en mérni. Minta vak lehetőség: a reagens helyett a megfelelő 1. illetve 3.-as oldatot bemérni (nitrit nélkül!). Reakcióidö szobahőmérsékleten: összbilirubin esetében 10-20 perc; direkt bilirubinnál: 5 perc!
A belső és külső minőségi kontroll szempontjából egyes anyagoknál a direkt bilirubin koncentració eredménye nagyban függ a reakcióidőtől, lásd esetünkben Level 2-nél. Erre nem árt, ha figyelünk!
Fontos: a direkt bilirubin nem azonos a konjugált bilirubinnal, noha sok cég a direkt bilirubin reagensét konjugált bilirubin reagensként nevezi meg.
A nem konjugált bilirubin reakciókészsége a kontroll, a kalibrátor feloldása után, hűtve tárolva, emelkedik. Ennek lehetséges oka a Z-Z forma részbeni átalakulása E-Z; Z-E; illeve E-E formába (5,6).
A direkt reagens esetében a színreakció abszorbancia maximuma 570 nm körül; az összbilirubin reagens esetében pedig 585 nm körül.
Bemérési arányok (reagens térfogat: minta térfogat) 20 : 1 - 40 : 1 határok között. Automatáknál, ha nagyobb pontosságot kivánunk és nagy bilirubin koncentrációjú minta nem várható, javasolt a 20 : 1 arány, egyébként a 30 : 1; 35 : 1 javasolható.
Megköszönjük Dr. Ferencz Antal professzor Írnak, hogy annak idején figyelmünket a Fossati féle módszerre felhívta.
A közlemény a szerzők által az MLDT 50-ik nagygyűlésén, Debrecenben, 2000. augusztusában tartott előadás nyomán készült.
Jendrassik L., Gróf P.:
Vereinfachte photometrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins.
Bioehem. Z. 1938; 297: 81-89
Doumas BT. et al.: Candidate
Reference Method for Determination of Total Bilirubin in Serum: Development
and Validation.
Clin Chem 1985; 31/11: 1779-1789
Fossati P. et al.: One-Step
Protocol for Assays of Total and Direct Bilirubin with Stable Combined
Reagents.
Clin Chem 1989; 3511: 173-176
Ferencz A. et al.: Lab. Med. 1993; 2: 88
Schmid R.: Bilirubin metabolism: state of the art. Gastroenterolog 1978; 74: 1307-1312
Szilágyi L, Irházi Gy.:
Jendrassik-Gróf féle bilirubin meghatározás standardizálása, különös
tekintettel az egyes módositásokra.
Laboratóriumi Diagnosztika 1993/4; XX: 231-248
Lo DH, and Tai-Wing Wu:
Assessment of the Fundamental Accuracy of the Jendrassik-Gróf Total and Direct
Bilirubin Assays.
Clin Chem 1983; 29/1: 31-36.