Identification of Mycobacteria in Solid-Culture Media by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry
Saleeb, Drake, Murray, and Zelazny
Journal of Clinical Microbiology, May 2011, p. 1790-1794
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice
Khéchine, Couderc, Flaudrops, Raoult, Drancourt
PLoS ONE, September 2011, Volume 6, Issue 9, e24720
A mycobacteriumok lassan növekvő mikroorganizmusok, több hét, hónap is eltelik a mintavétel és az izolálás, illetve fajszintű azonosításuk között. A MALFI-TOF MS technika a legtöbb baktérium esetében egyszerűen kivitelezhető módszerrel gyors identifikálásra képes.
A mycobacteriumok MALDI-TOF rendszerrel történő azonosítása során három technikai problémába ütközünk. Az első, hogy a mycobacterium speciesek veszélyesek lehetnek a laboratóriumi dolgozó számára, ezért érdemes olyan előkészítő protokollt választani, amely az előkészítés első lépéseiben elöli a kórokozót. A második, hogy a mycobacteriumok aggregálódnak, a harmadik probléma a fehérjék kiszabadítása a sejtfalon keresztül.
A fenti két cikk összefoglalja a különböző módszereket a mycobacteriumok MALDI-TOF-fal való azonosítására, és a legalkalmasabbnak a következő előkészítési protokollt találta:
1. 10 µl kacsnyi baktérium mennyiséget 500 µl desztillált vízben szuszpendálunk, és 95°C-os vízfürdőben 30 perc alatt inaktiválunk.
2. Vortexelés után mikropisztillussal 30 másodperc alatt elkeverjük a szuszpenziót.
3. Centrifugálás 13000 rpm, 2 percig, a felülúszót leöntjük.
4. Mosás 300 µl desztillált vízzel, újabb centrifugálás (13000 rpm, 2 perc), felülúszót leöntjük.
5. Az üledéket 1,2 ml 70%-os etanolban szuszpendáljuk, vortexelést követően centrifugáljuk (13000 rpm, 2 perc) a mintát, a felülúszót leöntjük.
6. 50 µl 70%-os hangyasavat és 100-200 µl 0,1 µm átmérőjű üveggyöngyöt adunk az üledékhez. 10 percig vortexeljük.
7. 50 µl 100%-os acetonitrilt adunk a mintához, és újabb 10 percig vortexeljük.
8. Centrifugáljuk (13000 rpm, 2 perc), és a felülúszót használjuk a MALDI-TOF analízishez. 1 µl felülúszóhoz 2 µl mátrixot adunk a targeten.
Ezzel a protokollal az említett cikkekben sikerült valamennyi vizsgált (104, illetve 124) klinikai izolátumot fajszinten azonosítani.
Referátumot készítette: dr. Pongrácz Júlia
